DESCUBRIMIENTO DE NUEVOS ANTIMALÁRICOS …
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mínimo y máximo y producto) de todos los ΔP se puede encontrar la mejor
combinación de modelos para el cribado de grandes bases de datos (36-‐38).
2.2. Métodos in vitro
El cultivo de
Plasmodium falciparum
fue mantenido en medio RPMI 1640
suplementado con Albumax (Gibco) 0,5 %, Hipoxantina (Sigma) 0,1% y glóbulos
rojos (grupo O+ o A+, 2% hematocrito). Se incubaron a 37°C y 5% CO
2
(39).
2.2.1. Microtest in vitro basado en florescencia para evaluar actividad
antimalárica
Usando placas de 96 pocillos se distribuyen 50 µl/pocillo de los productos
previamente disueltos en dimetilsulfóxido (Panreac), utilizándose 3 réplicas por
cada concentración, así como controles con Cloroquina (CQ) (Sigma) y
dimetilsulfóxido al 0.2 %. Posteriormente se distribuyeron 50 µl/pocillo del cultivo
de
Plasmodium falciparum
de las cepas 3D7 y Dd2, sensible y resistente a CQ,
respectivamente, con un hematocrito del 4 % y una parasitemia del 1 %, dejando
controles de crecimiento y de glóbulos rojos no parasitados. Después de 48 h de
incubación, se añaden 100 µl/pocillo de SYBR-‐Green (Applied Biosystem) (0.2
µl/ml) en una solución de buffer de lisis y se agitan las placas durante 15 min
protegidas de la luz. Seguidamente se mantienen durante una hora en reposo para
favorecer la acción del agente intercalante con el DNA parasitario.
La lectura de la fluorescencia se realiza en un espectrofluorímetro (Marca
Sunrise RC -‐ TECAN) a una longitud de onda de excitación de 485nm y de emisión
de 535nm (40). El porcentaje de inhibición (IC) se calcula usando la fórmula
siguiente:
Donde:
IF = Intensidad de Fluorescencia
2.2.3. Citotoxicidad inespecífica en macrófagos
Se mide la respiración celular como indicador de viabilidad celular basado
en la reducción a nivel mitocondrial de MTT [bromuro de 3-‐(4,5-‐dimetiltiazol-‐2-‐
il)-‐2,5-‐difeniltetrazolio
]
(Sigma) (41). Se emplearon macrófagos de la línea J774
mantenidos en frascos de cultivo celular de 75 cm
3
, mediante pases sucesivos en
medio RPMI-‐1640 suplementado con 10 % de suero bovino fetal, a 37 °C con 5 %
de CO
2.
Se despegan las células con una solución de EDTA/Tripsina en Fosfato
buffer salino (PBS) a 1 g/l. Se centrifugan a 1.500 rpm/5 min y se resuspenden en
medio fresco para determinar su concentración y viabilidad a través del recuento
en cámara de Neubauer con una solución de azul tripán (Sigma).
% IC = (IF Control –IF Compuesto) *100
IF Control
