YANETSY MACHADO TUGORES & col
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El cultivo se ajusta a 70.000 macrófagos en 100 µl/pocillo. Después de 24 h
de incubación a 37 °C con 5 % de CO
2,
se retira el medio y se añaden 200 µl de los
productos a evaluar previamente disueltos. Por cada concentración de los
productos se utiliza un pocillo sin macrófagos.
También se utilizan controles de dimetilsulfóxido al 0,2 % y de crecimiento
de células. Tras 24 h en contacto con los productos se retira el medio y se añaden
100 µl/pocillo de MTT (0,4 mg/ml) en PBS, incubándose a 37 °C/1 h. Los cristales
de formazán se disuelven con 100 µl/pocillo de dimetilsulfóxido. Se leen las
absorbancias a 595 nm y la actividad citotóxica se calcula empleando la formula:
Donde:
%C = porcentaje de citotoxicidad inespecífica
A= absorbancia.
2.2.4. Test de inhibición de la biomineralización de la ferroprotoporfirina IX
(FBIT)
En
Plasmodium
spp., la eliminación de la ferroprotoporfirina IX (FPIX)
durante el proceso de degradación de la hemoglobina, es un mecanismo
indispensable para la supervivencia del parásito por lo que un fármaco capaz de
inhibir la polimerización de la FPIX, podría ser letal para el parásito (42).
En una placa de 96 pocillos no estéril se colocó 50
µ
l de solución de
clorhidrato de hemina bovina en DMSO por pocillo a una concentración de 0.5
mg/ml, 100
µ
l de buffer acetato de sodio pH 4.4 por pocillo y 50
µ
l de cada uno de
los compuestos en estudio disueltos en DMSO. Se utilizaron como controles 50
µ
l
de DMSO y 50
µ
l de cloroquina difosfato (CQ).
Para cada concentración se colocaron 3 replicas, así como para los
controles. Las placas se incubaron a 37 °C por 18-‐24 horas y luego se centrifugaron
a 3000 rpm durante 5 minutos eliminando el sobrenadante.
A continuación, se añadió 150
µ
l de DMSO en cada pocillo y se centrifugó
nuevamente la placa a 3000 rpm durante 5 minutos, eliminándose de nuevo el
sobrenadante.
Posteriormente se colocaron 150
µ
l de hidróxido de sodio 0,1 N por pocillo,
realizándose la lectura de la absorbancia a una longitud de onda de 405 nm en un
lector ELISA (42).
El porcentaje de inhibición de cada producto de síntesis fue calculado
mediante la siguiente fórmula:
%C=100-‐[(A
fármaco
-‐A
blanco
)/A
control
-‐A
blanco
)]*100
