¿Un paso adelante hacia la clonación humana con fines terapéuticos?
245
embargo los embriones SCNT generados por la fusión HVJ-‐E no
sobrepasaban la fase de mórula a pesar de habérsele aplicado la
técnica estándar de activación con ionomicina/DMAP (activación
I/DMAP).
b.
Para mejorar la técnica se expusieron a un electropulso
(electroporación) embriones SCNT fusionados con HVJ-‐E antes de la
activación I/DMAP, obteniéndose un 10% de embriones SCNT que
alcanzaban la fase de blastocisto.
c.
Utilización de inhibidores de la histona desacetilasa, como la
tricostatina A (TSA), a bajas concentraciones (10 nM) y corto tiempo
de exposición (12 h).
2.
Optimización de la metodología para producir embriones humanos
SCNT y líneas NT-‐ESC:
a.
Utilizan 63 ovocitos humanos obtenidos por estimulación ovárica y
aspiración folicular transvaginal.
b.
Obtención de fibroblastos dermales de fetos femeninos
sincronizados en fase G0/G1 como donadores de núcleos.
c.
Eliminación del huso del ovocito MII y fusión con la célula somática
donadora con la técnica HVJ-‐E dentro de los 60 minutos desde la
obtención del ovocito.
d.
El 95% (60 de 63) de los ovocitos sobreviven a la eliminación del
huso MII.
e.
La introducción de los núcleos procedentes de los fibroblastos
donadores fusionados con la técnica HVJ-‐E se realizó al 100%.
f.
Los ovocitos fueron activados con electroporación/DMAP (4 h) y
expuestos a TSA (10nM durante 12 horas).
g.
De 63 ovocitos iniciales, sobrevivieron 60 (95,2 %) de los que 52
(86,7 %) comienzan a dividirse, llegando 32 (61,5 %) de ellos a la
fase de 8 células, 7 (13,5 %) hasta la fase de mórula y 6 (11,5 %)
hasta blastocisto SCNT, de los que solamente uno sobrevivió a la fase
de cultivo sobre capa nutritiva pero que no dio lugar a ninguna línea
celular NT-‐ESC.
3.
Modificación definitiva de la técnica:
a.
Dado que la eliminación del huso en ovocitos MII produce una
activación prematura, se asume que factores específicos de la
meiosis se retienen durante la eliminación del huso pero decaen en
su actividad debido a la activación espontánea. Por tanto, se decide
utilizar tratamientos no invasivos para mantener la parada meiótica
durante la manipulación, decidiéndose por la cafeína (inhibidora de
proteinfosfatasa) que, en 2007, Mitalipov y colaboradores habían
demostrado ser eficaz en ovocitos de macaco al impedir la activación
