J. de Juan-‐Sanz & col.
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2. MATERIAL Y MÉTODOS
Las ratas tipo Wistar fueron mantenidas en condiciones estándar en el
Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, siguiendo las pautas actuales en el uso
de animales en la investigación en Neurociencia. La glicina tritiada ([3H]-‐glicina) se
obtuvo en PerkinElmer Life Sciences y NFPS (inhibidor de GlyT1) y ALX-‐1393
(inhibidor de GlyT2) fueron adquiridos en Sigma-‐Aldrich. PGE2 y TCS250 se
obtuvieron de Tocris Biosciencie mientras que Beraprost, Butaprost y Sulprostona
se obtuvieron de Cayman Chemical, de donde provienen también los anticuerpos
específicos anti-‐EP1, EP2, EP3 y EP4. El anticuerpo para calnexina fue de Stressgen,
anti-‐multi Ubiquitina unido a agarosa se obtuvo de MBL international y el
anticuerpo anti GlyT2 fue producido en el laboratorio (3).
2. 1. Electroforesis y Western Blot
Tras medir la concentración de proteínas en las distintas muestras por el
método de Bradford, estas fueron sometidas a electroforesis en un gel de SDS-‐
PAGE utilizando geles concentrador (4%) y separador (7,5%). Las muestras fueron
transferidas a membranas de nitrocelulosa por electrotransferencia semiseca (Life
Technologies, Inc.; 1,2 mA.cm-‐2 1 h), se bloquearon con leche 5% en PBS durante 1
h a temperatura ambiente y se incubaron con los distintos anticuerpos de interés a
las concentraciones indicadas por los fabricantes, a 4ºC durante la noche. Tras
varios lavados, los anticuerpos unidos se detectaron con IgGs unidas a peroxidasa,
especificas para la detección de la especie en la que se obtuvo el primario. Las
bandas se visualizaron por ECL (VWR International, Canada). El análisis
cuantitativo de las bandas se realizó por densitometría en un densitómetro GS-‐800
de BioRad utilizando el software Quantity One 4.6.
2. 2. Obtención de sinaptosomas purificados de médula espinal de rata
Se sacrificaron 6-‐8 ratas adultas por intoxicación con monóxido de carbono.
Se decapitaron y se extrajeron las médulas espinales. Tras un homogeneizado en
potter tipo Dounce vidrio-‐vidrio, se realizaron las siguientes centrifugaciones a 4ºC
en rotores JA.25.50 de Beckman: a) 4 min, 5500 r.p.m. y se recuperó el
sobrenadante, b) 15 min, 14000 r.p.m. se retiró el sobrenadante y se resuspendió
el sedimento en buffer sacarosa 0,32 M pH 7,4. c) 7 min, 17000 r.p.m., tras colocar
la muestra en un gradiente discontinuo (25% -‐ 15% -‐ 5%) de Percoll (Sigma)
disuelto en buffer sacarosa 0,32 M pH 7,4. Se recuperó la interfase entre 15-‐25% y
se resuspendió en HBM (ClNa 140 mM, ClK 5 mM, Cl2Ca 1mM, Cl2Mg 1mM,
Na2HPO4 1mM, HNaCO3, HepesNaOH pH 7,4 20mM, Glucosa 10mM) para realizar
dos nuevas centrifugaciones que lavan el sedimento de Percoll d) 15 min, 15000
r.p.m. y e) 10 min 5500 r.p.m. Se resuspendió en HBM, se midió proteína por
Bradford y se ajustó a 2 mg/ml.
