Regulación de la neurotransmisión glicinérgica…
439
2. 3. Transporte de glicina tritiada en sinaptosomas
Tras el correspondiente tratamiento de los sinaptosomas con PGE2 u otro
compuesto, se midió la glicina tritiada incorporada en estos. Así, se añaden 40 µg
de sinaptosomas por condición (utilizando como mínimo cuadruplicados) a medio
HBM atemperado a 37ºC que contiene NFPS 10 µM (para inhibir GlyT1) y 2µl/ml
de [3H]-‐glicina, 1.6 TBq/mmol (PerkinElmer Life Sciences), diluida isotópicamente
una concentración de 10µM. Tras 10 minutos de incubación en agitación a 37ºC, se
lavaron con phosphate-‐buffered saline (PBS) (NaCl 137 mM, 0.9mM CaCl2, 2.68mM
KCl, 1.47 mM KH2PO4, 0.49mM MgCl2, 7.37 mM Na2HPO4, pH 7.4) para retirar la
[3H]-‐glicina no incorporada al interior de los sinaptosomas. El transporte de GlyT2
se mide como la diferencia entre la acumulación de [3H]-‐glicina a 10 µM, restando
la acumulación obtenida en presencia del inhibidor específico de GlyT2 (ALX-‐
1393) que correspondería al transporte basal de los sinaptosomas.
2. 4. Inmunoprecipitación anti-‐multi ubiquitina
Se separaron 200 ug de sinaptosomas por condición, que fueron lisados en
buffer de lisis conteniendo NP-‐40 0,25%, NaCl 150mM, Tris-‐HCl 25mM y N-‐
Etilmaleimida 50mM. Tras 30 minutos a temperatura ambiente en agitación, se
centrifugaron las diferentes muestras para retirar restos celulares no solubilizados
y se incubaron una hora a temperatura ambiente en presencia de un anticuerpo
anti-‐multi ubiquitina unido a agarosa (clon FK2). Las proteínas ubiquitinadas se
aislaron por precipitación de la agarosa mediante una centrifugación suave (8000
r.p.m., 3 min), se eluyeron a 75ºC durante 10 minutos y se cargaron en un gel SDS-‐
PAGE, revelando por western blot la cantidad de GlyT2 ubiquitinado.
2. 5. Análisis estadístico
Los datos se muestran como medias ± error estándar de la media (Standard
Error Mean, SEM). Las diferencias estadísticas entre dos grupos se determinaron
por una prueba t de Student, mientras que la comparación entre más de dos
grupos se realizó mediante el análisis de la varianza (ANOVA, ANalysis Of
VAriance, según terminología inglesa). P < 0,05 se consideró significativo, y es
denotado con *. Otras equivalencias son ** para P < 0,01 y *** para P < 0,001.
3. RESULTADOS
3.1. PGE2 activa la recaptación de glicina mediada por el transportador GlyT2
a través de la activación de los receptores EP3
Teniendo en cuenta el papel crítico que juega GlyT2 en la neurotransmisión
glicinérgica (21) y la regulación que PGE2 produce sobre la misma (14), nos
preguntamos si la actividad de GlyT2 se vería afectada junto a la del receptor de
glicina, modulando de manera coordinada el proceso desde las neuronas pre-‐ y
postsinápticas. Para ello medimos la actividad específica de GlyT2 en sinaptosomas
